در ابتدای نيمه ی قرن بيستم ، محصول ايمنی همورال يعنی آنتی بادی ها يکی از نقاط عطف در مقوله ی روش های سنجش را بوجود آوردند . آنتی باديها با اتصال ويژه به آناليتی که بر ضد آنها تهيه شده اند ، به عنوان ابزاری مناسب برای سنجش های ويژه و سريع در اختيار محققان قرار گرفتند . روش هايی که از آنتی باديها به عنوان فاکتور شناساگر بهره می گيرند ، روش های سنجش ايمنی نام دارند .
تمامی سنجش های ايمنی که بر اساس واکنش تعادلی و غير کووالانسی بين ايمونوگلوبولين و آناليت ها بنا شده اند ، در اصل از مهمترين روش های سنجش اتصال ليگاند به شمار می آيند . بر هم کنش آنتی بادی با آناليت عمدتاً از نوع هيدروژنی و واندروالس است . اين بر هم کنش ناشی از مکمل بودن شکل فضايی ناحيه متغير آنتی بادی با بخشی از ساختمان آناليت می باشد . اغلب ، آنتی بادی های پلی کلونالی که در سنجش های ايمنی بکار می روند از نوع IgG هستند .
بر هم کنش ميان آناليت و آنتی بادی فيزيکی است ، يعنی تغيير شيميايی در ساختمان آناليت يا آنتی بادی بوجود نمی آيد . به هر حال واکنش ويژه ميان آناليت و آنتی بادی اساس کليه روش های سنجش ايمنی می باشد . به منظور رديابی واکنش مذبور از سيگنال دهنده های مختلفی بهره گرفته اند . مثلاًاستفاده از ماده ی راديو اکتيو سنجش های RIA ، IRMA و استفاده از سيگنال دهنده های آنزيمی سنجش های EIA ، IEMA را بوجود آورده است .
· اساس روش های سنجش ايمنی
شناسايی آناليت ، اولين مرحله در اين نوع سنجش محسوب می شود . اين عمل توسط آنتی بادی انجام می پذيرد . به عبارتی ، جزء لا ينفک هر سنجش ايمنی واکنش ميان آنتی ژن و آنتی بادی است . در محدوده ی معينی از غلظت آنتی ژن و آنتی بادی انجام واکنش منجر به تشکيل رسوب قابل رويت ( قبل يا بعد از رنگ آميزی ) می گردد . اما در اغلب موارد ، قبل و بعد از انجام واکنش آنتی ژن و آنتی بادی تغيير قابل مشاهده ای وجود ندارد ، به همين دليل وجود سيستم نشانه گذاری ضروری به نظر می رسد . نوع طبقه بندی سنجش های ايمنی آنزيمی بر اساس نوع نشاندار سازی است .
همانطو که اشاره شد در اين روش نيز می توان جهت رديابی واکنش ، آنتی ژن و ِيا آنتی بادی را با آنزيم نشاندار ساخت . به عمل نشاندار سازی ، کونژوگاسيون و به مولکول آنزيم دار ، کونژوگه ی آنزيمی نيز می گويند . چنانچه آنتی ژن کونژوگه گردد روش را EIA ( Enzyme Immuno Assay ) گويند و اگر آنتی بادی کونژوگه گردد روش را IEMA ( Immuno Enzymo Meteric Assay ) می نامند .
اساس روش EIA ، رقابت ميان آنتی ژن کونژوگه و آنتی ژن آزاد در نمونه مورد سنجش بر سر اتصال به آنتی بادی است . در اينجا ميزان کمپلکس آنزيم دار با آنتی ژن آزاد رابطه معکوس دارد . لذا می توان بسته به نياز آنتی بادی های پلی و يا مونو کلونال استفاده کرد . البته در برخی سنجش ها آنتی بادی های اليگو کلونال پاسخ بهتری ايجاد می کنند . چنانچه چند نوع آنتی بادی مونو کلونال را با هم مخلوط کنيم ، مجموعه حاصله را آنتی بادی اليگو کلونال می نامند .
· مزايای IEMA نسبت به EIA :
1- سادگی نشان دار کردن 4 – سرعت بيشتر واکنش
2 - افزايش حساسيت 5 – محدوده ی وسيع تر از غلظت آناليت
3 - ويژگی بالاتر 6 – مقاومت بيشتر در برابرشرايط آزمايش
اجازه دهيد به برخی از مزايای روش های سنجش ايمنی آنزيم دار نسبت به سنجش ايمنی راديو اکتيو اشاره ای داشته باشيم :
1 – عدم وجود خطر تشعشع 5 – امکان اتوماسيون
2 – قيمت ارزانتر دستگاه ها 6 – سرعت خوانش بالا
3 – معرف های ارزان 7 – امکان افزايش حساسيت روش
4 – نيمه عمر طولانی کيت های آنزيمی
شايد اولين گزارش در مورد تداخل در سنجش ايمنی در مورد هپاتيت B توسط Sgouris مطرح شد . وی در سنجش آنتی ژن مذکور اغلب دچار خطای مثبت کاذب می شد . در اين تحقيق ، مشکل با افزايش سرم حاوی ايمونوگلوبولين های طبيعی حل شد . به
دنبال اين گزارش گروهی از محققان به بررسی عميق تداخلات در سنجش های ايمنی و
و رفع آنها پرداختند. محققانی چون Kroli ، Elin ، Chapman سهم زيادی در اين زمينه داشته اند .
· متغير ها قبل از سنجش
تمامی عواملی که قبل از انجام آزمايش و زمان انتخاب نوع نمونه ، شيوه نمونه گيری نگهداری و ارسال آن بر نتيجه سنجش تاثير داشته باشند را متغير های قبل از سنجش گويند
اين متغير ها بر دو نوع هستند:
1 – متغير های وابسته به بيمار 2 – متغير های وابسته به نمونه
توجه داشته باشيد که عواملی مانند زمان نامناسب نمونه گيری يا فاکتور های محيطی مانند سيگار کشيدن هر چند که آزمايش را تحت تاثير قرار می دهند اما به عنوان عامل مداخله گر نيستند .
· متغير های وابسته به نمونه
محکم بستن يا طولانی شدن مدت تورنيکت بر روی وريدها باعث افزايش فشار و خروج مايعات از وريدها به فضای ميان بافتی گرديده ، غلظت برخی از آناليت ها را افزايش می دهد مثلاً اين شرايط باعث 5% افزايش در ميزان پروتئين فرد می شود و به تبع آنها ليگاندهای متصل به آنها نيز افزايش ميابد .
ماهيت نمونه : تقريباً تمام سنجش های ايمنی از سرم به عنوان نمونه مورد بررسی استفاده می کنند . در مواردی که بيمار نياز به آزمايشاتی مانند CBC دارد وجود پلاسما آزمايشگر را تشويق می کند تا از نمونه گيری مجدد پرهيز کند و از پلاسما به عنوان نمونه مورد سنجش استفاده نمايد . هر چند در اغلب سنجش های ايمنی تفاوتی ميان نتايج سرم و پلاسما وجود ندارد اما به هر حال با توجه به تفاوت زمينه ( Matrix ) اين دو نمونه ، اعتبار جايگزينی پلاسما به جای سرم بايد اثبات شده باشد .
استفاده از پلاسمايی که از ليتيم هپارين ( Li . Hep ) به عنوان ضد انعقاد در مورد آن استفاده شده در اکثر موارد قابل قبول است اما در مورد پلاسمايی که از EDTA به عنوان ضد انعقاد استفاده کرده اند بايد با احتياط بيشتری رفتار شود . آلودگی نمونه ها می تواند منشا خطا در سنجش باشد .
وجود غلظت های بالای هموگلوبين در نمونه های هموليز با بر هم کنش پروتئينی در به تعادل رسيدن واکنش آنتی ژن _ آنتی بادی تداخل ايجاد کرده ، زمان به تعادل رسيدن را افزايش می دهد .
اغلب آناليت ها پايداری خوبی دارند و حتی اگر گويچه های خونی از سرم جدا نشوند می توان بسته به نوع آناليت چند روز اين نمونه را در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری نمود . به عنوان مثال هورمون های ، TSH ، FT4 ، PRL ، LH ، FSH و PSA در نمونه سرمی به مدت دو هفته در دمای 4 درجه سانتی گراد پايدار می مانند .
· تاثير معرف ها ( Reagents Effect )
قدرت يونی و PH بافر ها بسيار مهم است . خصوصاً زمانی که از آنتی بادی های مونوکلونال با PH ايزوالکتريک بين 5 تا 9 استفاده می شود . استفاده از PH و قدرت يونی مناسب ، اتصال غير ويژه به جداره ظرف واکنش را به حداقل می رساند . معمولاً در بافرها از مقدار کمی پروتئين و دترژان برای کاهش اتصال غير ويژه بهره گرفته می شود و اين عمل به افزايش دقت کمک می کند . استفاده از جابجا کننده ها ( Displacers ) سبب جدا شدن مولکول های آنتی بادی با اتصال ضعيف می شود . از آنجائيکه آنتی بادی ها معمولاً با پيوند غير کووالانس به سطوح جامد متصل می شوند ، استفاده از مقادير کنترل شده دترژان به کم شدن اتصالات غير ويژه کمک می کند اما اگر ميزان آن از حد معينی بيشتر شود سبب دناتوره شدن آنتی بادی ها و جدا شدن آنها از سطوح جامدی می شود که بر روی آن تثبيت شده اند.
برخی از دترژان ها به دليل مسير واکنش سنتزشان ، حاوی پراکسيدهايی می باشند که قادر به تخريب واکنش آنتی ژن _ آنتی بادی هستند . از آنجائيکه محيط های بافر اغلب برای رشد ميکروارگانيسم ها بسيار مناسب هستند ، در صورتيکه ترکيبات نگهدارنده به محيط افزوده نشود مورد هجوم ساپروفيت ها و باکتری ها قرار می گيرند اما بايد مراقب بود که برخی از اين نگهدارنده ها مانند آزيد سديم در بخش های ايمنی آنزيمی که از پراکسيداز ها استفاده می کنند ، مهار کننده محسوب می شوند .
· تاثير پروتئين ها :
مهمترين پروتئين هايی که سبب تداخل در برخی از سنجش های ايمنی می شوند ،عبارتنداز
آلبومين ، فاکتور روماتوئيد ، کمپلمان ، ليزوزيم و فيبرينوژن .
· پروتئين های هورمون گير داخلی :
اينگونه پروتئين های هورمون گير با غلظت های متفاوت در تمام سرم ها و پلاسما ها وجود داشته ، می توانند منشا تداخل در سنجش های ايمنی باشند . هم نوع و هم غلظت اين پروتئين ها تحت تاثير عوامل ارثی و اکتسابی قرار دارند . از ميان اين پروتئين ها آلبومين اهميت زيادی دارد چرا که هم بيشترين غلظت را داشته و هم به طيف وسيعی از آناليت ها از جمله هورمون ها متصل می گردد . برخی از پروتئين های هورمون گير عبارتند از :
1 ) گلوبولين تيروکسين گير؛ 2 ) گلوبولين کورتيکو استروئيد گير ؛ 3 ) گلوبولين گيرنده هورمون جنسی ؛ 4 ) آلبومين ؛ 5 ) پره آلبومين ؛ 6 ) ترنسفرين
يکی از رايج ترين و کارامد ترين روش های جدا سازی در سنجش های ناهمگون استفاده از فاز جامد يا تثبيت يکی از کمپلکس می باشد . با تثبيت آنتی ژن يا آنتی بادی ، کمپلکس به فاز جامد متصل می ماند ، لذا باشستشویساده مولکول سيگنال دهنده آزاد از محيط خارج می شود . تاکنون از فاز های جامد متعددی استفاده شده است :
1) دانه های ( Beads ) پلی استيرن ؛ 2 ) لوله های پلی استيرنی با چاهک های ( Wells ) مربوطه ؛ 3 ) سلولز ؛ 4 ) نايلون ؛ 5 ) ذرات مغناطيسی
روش های فوق بسيار ساده و عملی می باشند اما جذب غير اختصاصی مولکول نشاندار يکی از مشکلات اصلی می باشد که خوشبختانه با استفاده از محلول های شستشو گر حاوی املاح دترژان اين مشکل نيز تا حدود زيادی برطرف شده و در مواردی تثبيت آنتی بادی با کاهش فعاليت آن همراه است . اين موضوع کاربرد اين روش را کمی محدود می سازد .
· طبقه بندی الايزا :
سيستم الايزا بر اساس شيوه شناسی تشخيصی به چند گروه تقسيم می شود که عبارتند از :
1 – الايزای مستقيم ( Direct ELISA ) :
در اين روش آنتی ژن يا آنتی بادی موجود در نمونه که بايد تشخيص داده شود بطور
مستقيم بر سطح فاز جامد کوت می شود و سپس آنتی بادی يا آنتی ژن مکمل آن نشاندار شده است به سيستم اضافه می شود . در صورت وجود آنتی ژن يا آنتی بادی مورد نظر در نمونه سيگنال مناسب ايجاد می شود . اين روش کاربرد چندانی در کيت های تشخيصی ندارد و بيشتر در کاهای تحقيقاتی استفاده می شود .
2 – الايزای غير مستقيم ( Indirect ELISA ) :
اين روش برای تعيين آنتی بادی اختصاصی و يا تيتراسيون آنتی بادی در نمونه های سرم مورد استفاده قرار می گيرد . اساس آزمايش بدين نحو است که معمولاً سرم رقيق شده به آنتی ژن های کوت شده در فاز جامد ( ميکروول يا چاهک ) اضافه می شود . آنتی ژن کوت شده آنتی ژن اختصاصی مربوط به آنتی بادی است که قرار است در نمونه رد يابی شود ، پس از افزودن نمونه و طی زمان انکوباسيون و يک مرحله شستشو آنتی هيومن گلوبولين نشاندار شده با آنزيم به چاهک اضافه می شود بر حسب اينکه چه کلاسی از آنتی بادی برای رديابی اهميت دارد نوع آنتی هيومن مورد استفاده نيز متفاوت است مثلاً برای رديابی آنتی بادی کلاس IgG از آنتی هيومن IgG و برای رديابی کلاس IgA از آنتی هيومن IgA استفاده می شود . بهترين مثالها در مورد اين روش تعيين آنتی بادی بر عليه توکسوپلاسما ، روبلا ، ويروس سيتومگال و هليکوباکتر پيلوری از کلاس IgM ، IgA و IgG در سرم می باشد .
3 – الايزای ساندويچ :
روش ساندويچ الايزا خود به دو دسته تقسيم می شود :
الف ) روش Ag Capture يا Ab sandwich :
در اين روش يک آنتی ژن در بين دو آنتی بادی اختصاصی قرار می گيرد ، اين روش شايع ترين روش الايزا محسوب می شود ، در اين روش از يک آنتی بادی برای به دام انداختن آنتی ژن بر روی چاهک های الايزا استفاده می شود و آنتی بادی دوم که با آنزيم نشاندار شده است به عنوان شناساگر عمل می کند .
قابل ذکر است که در اين روش آنتی ژن بايد دارای دو ناحِيه آنتی ژنيک متفاوت باشد تا قادر به اتصال به هر دو آنتی بادی باشد ، مثال های بارز اين روش اندازه گيری ،TSH ، LH ، FSH ، PSA ، HCG و ...
ب ) روش Antibody Capture :
· Ag Sandwich or Direct Ab Capture :
اين روش برای تعيين سنجش آنتی بادی مورد استفاده قرار می گيرد بدين صورت که از يک آنتی ژن کوت شده بر روی فاز جامد به دام انداختن آنتی بادی اختصاصی آن استفاده می شود و همان آنتی بادی از طريق بازوی ديگر خود ( Fab ) پذيرای همان آنتی ژن اما به صورت نشاندار می باشد ، در نتيجه آنتی بادی اختصاصی در بين دو آنتی ژن ساندويچ می گردد . در اين روش تعيين آنتی بادی توتال از هر کلاس ايمونوگلوبولين ميسر است و يکی از اختصاصی ترين و حساس ترين روش ها برای تشخيص آنتی بادی در نمونه است . مثال بارز اين روش کيت اندازه گيری آنتی بادی بر عليه پلاسموديوم ويواکس و ترپونما پاليدوم و HBsAb می باشد.
4 – الايزای رقابتی يا مهاری
در روش های رقابتی اساس سنجش بر رقابت دو آنتی ژن يا دو آنتی بادی ( که يکی از آن دو نشاندار است ) برای اتصال ليگاند با مقدار محدود استوار است اگر هردو آناليت نشاندار و غير نشاندار با هم به سيستم اضافه شوند روش را رقابتی می نامند ولی چنانچه ابتدا آناليت اضافه شده و پس از يک دوره انکوباسيون آناليت نشاندار اضافه گردد روش را مهاری يا بلاکينگ می نامند . در روش مهاری ممکن است در بين دو مرحله و قبل از اضافه نمودن آناليت بعدی شستشو انجام شود يا انجام نشود ، مثال بارز روش های رقابتی و مهاری سنجش T4 و T3 می باشد .انواع روش هاای رقابتی عبارتند از :
الف ) روش سنجش رقابتی يا مهاری برای آنتی ژن :
اساس اين روش بر رقابت بين آنتی ژن نشاندار و آنتی ژن موجود در نمونه برای اتصال به يک آنتی بادی اختصاصی کوت شده در چاهک استوار است . در اين روش مقدار آنتی بادی کوت شده بايد محدود باشد و ملکول سيگنال دهنده همان آنتی ژن نشاندار است ، اساس روش RIA و EIA کلاسيک همين روش است .
در اين روش منحنی پاسخ – دوز به صورت معکوس خواهد بود ، بدين معنی که آناليت نشاندار در حضور مقادير زيادی از آناليت غير نشاندار موجود در نمونه کمتر به آنتی بادی متصل می شود و در نتيجه سيگنال کمتری هم وجود خواهد آمد .
در برخی از موارد نشاندار کردن روی خصوصيات هاپتن اثر می گذارد در نتيجه در روش رقابتی برای تعيين آنتی ژن از يک آنتی بادی نشاندار استفاده می شود ، در اين از سنجش ها اين مطلب ضروری است که فاز جامد توسط آنتی ژن با مقدار کم و ثابت پوشيده می شود ، در اين روش آناليت موجود در نمونه با آناليت کوت شده در چاهک برای اتصال به آنتی بادی نشاندار رقابت می کند . در اينجا هم منحنی استاندارد معکوس است ، از اين روش بيشتر برای سنجش ايمنی به روش کمی لومينسانس استفاده می شود .
ب ) روش رقابتی برای آنتی بادی :
در اين روش رقابت بين دو آنتی بادی يکی در نمونه به صورت غير نشاندار و يکی به صورت نشاندار شده با آنزيم برای اتصال به يک آنتی ژن کوت شده در چاهک صورت می پذيرد ، بديهی است که هر چه مقدار آنتی بادی نمونه بيشتر باشد آنتی بادی نشاندار کمتری به چاهک ها متصل شده و سيگنال نيز کمتر خواهد بود و در نتيجه منحنی استاندارد نيز معکوس می باشد ، شاخص ترين مثال برای اين روش اندازه گيری آنتی بادی بر ضد HBc ( HBc Ab ) است .
· وسايل شستشو
شستشو به دو صورت دستی و اتوماتيک صورت می گيرد .
1 – روش دستی :
ساده ترين روش برای شستشو ريختن مايع شستشو با پی پت بر روی چاهک ها و در ادامه خالی کردن آنها بر روی سينک می باشد . ولی اين روش وقتی که تعداد پليت ها زياد باشد بسيار طاقت فرساست . از سوی ديگر ، امروزه دستگاه های شوينده 8 و يا 12 کاناله که به پمپ اتصال می يابند وارد بازار شده اند که عموماً نيز دارای دو نيدل می باشند ؛ يکی برای ريختن و ديگری برای خالی کردن محلول شستشو.
اين دستگاه ها بسيار موثر و تقريباً سريع بوده و توسط افراد مجرب مورد استفاده قرار می گيرند.
2 – شستشوی اتوماتيک :
دستگاه های اتوماتيک به اشکال مختلفی وجود دارند . برخی از آنها 8 يا 12 کاناله بوده و برخی ديگر کل پليت را شستشو می دهند . بعضی از اين دستگاه ها تک سوزنه و بعضی دو سوزنه هستند که در انواع تک سوزنه تمامی اقدامات توسط همان سوزن صورت می گيرد . ولی در دستگاه های دو سوزنه يک سوزن بطور دائم در حال مکش است تا چنانچه مايع شوينده بيشتری در هنگام پر کردن وارد چاهک ها شد ، آنرا خالی نمايد.
· الايزا ريدر يا خوانشگر الايزا ( ELISA Reader ) :
امروزه انواع مختلفی از خوانشگرها برای پليت ها ی الايزا در بازار موجود می باشند اکثر اين خوانشگرها يک ستونی و يا 96 خانه (يک پليتی ) بوده و اکثراً اتوماتيک و تعداد اندکی نيز دستی هستند .
اين دستگاه ها در قسمت سيستم نوری خود از فيبرهای نوری بهره می برند .
در بسياری از خوانشگرها سيستم تک موج يا دو موج ( Dual beam ) بچشم می خورد که در سيستم اخير تصحيح جذب نوری جهت برطرف سازی نقص سيستم نوری ، تغييرات چاهک به چاهک حجم نهايی در چاهک ها بطور اتوماتيک صورت می گيرد . اين عمل توسط نوع خاصی از فيلترتحت عنوان فيلترهای افتراقی (Filters Differential) صورت می گيرد . در دستگاه های خوانشگر انتخاب طول موج توسط فيلترها و يا گريدها صورت می گيرد . گريد ها ساختارهايی هستند که با تابيده شدن نور به آنها ، تنها نور با طول موج خاصی ازآنها ساطع می شود .
به نام خدا :